非成像式流式细胞仪的发展与应用

　　引 言

　　流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）也称为荧光激活细胞分类术（Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS） ，是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或者生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞仪（Flow Cytometer）是集激光技术、光电检测技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术以及计算机技术于一体的新型高科技仪器。它能够高效检测细胞大小、粒度、表面积等细胞结构参数和细胞表面 / 胞质 / 核的特异性抗原、细胞内细胞因子、酶活性、Ca2+、细胞活性等细胞功能参数， 同时还具有细胞分选和计数能力。自上世纪70年代第一台流式细胞仪问世以来，历经 40 多年的迅猛发展，目前流式细胞仪已经广泛应用于生物学、药理学、免疫学、血液学、肿瘤学以及细胞凋亡检测和临床检验等领域。

　　1  流式细胞仪的结构

　　流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统和细胞分选系统 4 部分组成。经过特定荧光染色的待测样本细胞悬液，在鞘流的包围约束下，细胞成单列排布，由流动室喷嘴高速喷出，形成细胞液柱。液柱与激光束垂直相交，相交位置即为检测区，在入射激光照射下产生荧光信号和前向散射光信号（FSC，Forward Scatter）与90°侧向散射光信号（SSC，Side Scatter） ，可被电子系统检测并输入到计算机利用专业软件进行细胞多参数分析与分选。

　　1.1  液流系统

　　液流系统主要负责将待测样品从样品室运送到流动室的测量区域，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心，并且在一次曝光时间内，只允许一个细胞通过激光束，然后根据需要，液流流入废液桶或者分选收集管。液流系统主要由流动室和液流驱动系统构成。流动室内充满鞘液，根据层流原理，在鞘液的包围下，细胞排成单列从流动室的喷嘴流出，并且被鞘液包围形成细胞液柱。另外，同轴流动的设计，使得样品流（核流）和鞘流始终保持分层鞘流的状态。

　　1.2  光学系统

　　光学系统负责产生并采集荧光、散射光信号，主要由包括激光、光纤、光束形成棱镜、聚焦镜的光学激发系统和包括荧光物镜、光纤、光学滤片、检测器的光学采集系统组成。目前流式细胞仪广泛使用的是 488nm 的氩离子激光器和 635nm 的氦 - 氖激光器。光学滤光片放置在光电倍增管前面，对去除干扰信号、提高结果的准确性至关重要。

　　1.3  电子系统

　　电子系统的功能是将荧光和散射光信号转换成电信号， 并进行数字化处理后送入计算机用专用软件进行分析，包括光电转化器、信号放大器、信号处理系统和计算机软件分析系统。液柱中的细胞经过测量区域被激光照射，产生荧光信号和前向角散射与 90°侧向角散射信号。其中荧光信号由光电倍增管检测，2 个散射光信号由光电二极管检测。荧光信号与产生荧光的化学物质有关，前向散射光信号与细胞大小有关，90°侧向散射光信号与细胞粒度有关。通过安装多个滤光片和不同波长的激光器就能得到更多的荧光信号和散射光信号，这对于人们认识细胞内化学物质的相互作用具有十分重要的现实意义。

　　1.4  分选系统

　　利用流动室喷嘴上的高频压电晶体的振动，将液流变成只包含单个靶细胞的小液滴，系统根据鞘流的流速与晶体振动的频率，精确算出小液滴的间距，然后对其施加相应的电压，当小液滴通过正负极板时就会发生偏转，流入相应的收集管里， 不带电的液滴就会流入中间的废液桶里，从而实现对细胞（ 包括中性粒细胞 ） 的分选 　　。

　　2  流式细胞仪的最新进展

　　2.1  光学系统的完善

　　随着激光技术的发展，激光器的性能更加优异，价格也更加低廉，这使得激光逐渐取代非相干光源，在流式细胞仪中得以广泛应用。目前，除德国的Partec 等公司的部分产品仍使用汞灯作为光源激发紫外的荧光物质外，多数的流式细胞仪都配备多个激光器，同时发出不同波长的激光以激发出多种荧光。例如BD 公司的 FACSAria 流式细胞分选仪除配备较为常用的488nm蓝光和640nm红光外，还配备 407nm 光源。同时，染料激光器的出现，使得光源发出连续可调的光谱成为可能，极大地扩展波长范围，可以满足用户多种特殊的需求。另外，通过配备多个光学滤光片，可同时检测多种荧光信号和包括 FSC 和 SSC 在内的信号，丰富人们的视野，更好地实现对细胞的检测。

　　2.2  灵敏度和分辨率的提高

　　灵敏度反映仪器能够检测到最弱的荧光和散射光信号，直接决定能否检测出待检测指标。灵敏度主要与待检测物体被激光照射效率和荧光接收效率有关，灵敏度的高低也是衡量流式细胞仪性能的最重要指标之一 ［4］。通过使用更加贴近最大吸收波长的激发光源和改善光路系统设计能够有效提高流式细胞仪灵敏度，同时，使用较高灵敏度的光电检测元件也可以分析微弱的荧光信号，较大程度上提高流式细胞仪灵敏度。目前流式细胞仪多使用石英微流动室 和数值孔径较大的物镜，使得收集到的细胞荧光信号显著增强。另外，通过使用光子计数系统，也能够实现对一些微弱荧光信号的检测。光子计数系统具有较高灵敏度，但是检测面积比较小，使用时应该用高质量的透镜组将光子汇聚到它的有效面积上。随着荧光技术的发展，市场上出现更多类型的荧光染料可供选择，荧光的激发光强也有很大的提高， 实现灵敏度提高。另外， 使用高透射率、高折射率的光纤，也能够更好地与光源、光电检测器和芯片耦合，显著降低光强损失，提高仪器灵敏度。

　　随着液流系统、光电检测技术和计算机技术的发展，流式细胞仪的分辨率也有显著提高。目前市场上流式细胞仪的分辨率可以达到 1 ∶ 512000，能够得到 CV 值（变异系数）很小的实验数据， 彻底改变以往很难把染色体区分开的局面，这使得分辨率较高的染色体的分析和分选成为可能。同时，随着灵敏度和分辨率的提高，实验所需的样品容量也进一步减少，如 C6 流式细胞仪最小的样品大小仅为 30µL，这对于难以获得较大样品量的研究实验具有十分重要的意义。[page]

　　2.3  分析和分选速度的提高

　　流式细胞仪非常重要的一个特点就是它能够实现高速的细胞定量分析和目标细胞的分选。随着液流控制系统性能的改进和光电检测元件响应速度和计算机软件系统的不断发展进步， 流式细胞仪的分析和分选速度都有质的提高。目前，BD 公司出品的 FACSAria 流式细胞分选仪获取速度可达 70000 个细胞 /s，分析速度可达 50000 个细胞 /s。这对于要通过对大量细胞的分析，建立不同细胞类型的数据库具有十分重要的现实意义，如根据细胞形态变化和内部结构的变化对肿瘤细胞进行分类等。

　　2.4  实现多色分析

　　流式细胞仪另一个非常重要的特点就是它能够实现对细胞的多参数测量。通过使用多种荧光标记物对细胞进行标记，测量激光激发多色荧光信号，实现单次实验对细胞多种成分测量。然而，实际中荧光标记物的发射光谱多较宽，不同的标记物标记细胞后，光电检测器检测到的荧光信号往往有重叠的现象，这就需要对荧光信号进行补偿。目前 BD 公司研发的细胞多色分析技术居于领先地位，它采用多根激光束同时激发流动室中的一个细胞，激发出来的荧光信号分别经过系统中的多个光学滤光片，被不同的光电检测器检测，这样就可以解决荧光信号重叠的问题，使多色分析达到最佳效果。BD 产品最多可进行15 色荧光分析和前向、侧向散射光分析，这样单次实验就可以同时获得多达17个参数，提供丰富的细胞信息。

　　2.5  仪器小型化 

　　低功耗、小型化、便携式的细胞分析分选仪器，一直都是各大厂商和科研院所的研究方向。随着激光光源、光电检测器件、电子计算机等相关领域的发展，器件的性能更加优越，体积也更小，这使得流式细胞仪的小型化取得很大进展。目前市场上的 C6 流式细胞仪的体积比小型微波炉还要小，重量不足 14kg，功耗也不超过 70W，是真正意义上的小型化分析仪器。

　　以 MEMS 技术（微机电系统）为基础的微流控芯片（microfluidic chip） 技术具有体积小、效率高、集成度高、速度快等特点，为生化分析领域开辟新的研究方向。国外课题组在这方面已经做很多研究。Hirono 等人采用LED 作光源的微芯片流式细胞成像分析系统实现对血小板凝集数量的计数。Wolff 课题组研制一种微芯片细胞分选器，他们将激光光源、检测器件和细胞的培养室统统集成到一个微型芯片上。该细胞分选器具有尺寸小、分选效率高、价格低等特点，同时采用封闭体系可以有效防止污染，满足环保要求。国内方面也有很多课题组从事这方面研究。姚波等人采用静电力的方法实现对细胞的筛选。当细胞经过检测区后，在芯片出样管道的分支处被施加不同电压，带电荷细胞进入出样管道后，在静电场力作用下，发生不同方向的偏转，进入到相应的收集管里，同时， 为有效消除电渗流影响， 他们还对管壁做涂层处理。

　　2.6  仪器自动化

　　以往流式细胞仪的使用都比较繁琐，使用起来有相当的难度。随着计算机技术、自动控制技术发展，目前流式细胞仪在进样、液流控制、多色荧光分析、细胞分选和数据处理等方面都已经实现自动化。例如 BD 公司的FACSAria 细胞分选仪配备液流自动控制系统和软件自动清洗程序，实现进样仓自动加压、自动混匀样本、自动冲洗进样管路、液滴监控、自动检查堵塞。系统软件的分选设定和检测功能大大简化操作， 实现细胞分选的无人操作。

　　3  流式细胞仪的应用

　　随着各种新型的荧光染料和单克隆抗体技术的发展应用，流式细胞仪在生物学和医学领域的应用范围得到进一步的扩展。目前，基本上能进行荧光分子标记的细胞或者亚细胞微粒都能被流式细胞仪检测，下面简要介绍流式细胞仪在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等部分领域的应用。

　　3.1  在细胞生物学的应用

　　细胞内 DNA 的含量在整个细胞周期内随时都发生周期性的变化，通过荧光探针对细胞内 DNA 含量进行测量，能够有效分析各个时相的细胞百分比以及 DNA 异倍体。相对于传统染色体核型分析，流式细胞仪不仅能够实现染色体分析还能进行纯化，以获得克隆实验所需的染色体。同时， 流式细胞仪因其具有高效分析和分选能力，在分子遗传学中也有大量应用，主要是用于研究分离的染色体，以及对特定的染色体进行分选。流式细胞仪在微生物领域的应用相对较晚，但它快速、多参数测量的特点十分适合解决微生物学面临的一些问题。目前，在工业上流式细胞仪能够用于微生物的快速鉴定，例如对自来水中的微生物学鉴定和控制、对生乳中细菌总数的检测等。

3.2  在肿瘤学中的应用

　　流式细胞仪在临床医学中最早应用于肿瘤学，主要是通过 DNA 含量和线粒体数量检测进行癌前病变和早期癌症的诊断以及化疗指导和愈后评估等。流式细胞仪能够精确检测细胞内 DNA 含量，可对癌症的性质和发展趋势进行判断，利于早期诊断。实际应用中需要将实体瘤组织解聚、分散制成单细胞悬液，并用荧光染料（碘化吡啶PI）染色，对细胞内的 DNA 含量进行检测。同时需要将不易区分的群体细胞分成 G1 期、S 期和 G2 期 3 个细胞亚群，DNA 的含量直接代表细胞的倍体状态，肿瘤的恶性程度和非倍体细胞有密切关系。流式细胞仪还可对恶性肿瘤 DNA 倍体异质体进行检测，对患者临床分期、病理分级、肿瘤转移具有重要意义。肿瘤早期诊断的一个重要依据就是 DNA 非整倍体细胞峰的存在。同时，细胞的 DNA 倍体分析也能够用于病人愈后情况的早期判断。异倍体肿瘤恶变的复发率和死亡率都比较高，然而，二倍体和近二倍体肿瘤的愈后状况明显比较好。流式细胞仪除能对癌症 DNA 含量进行分析外，还能够根据癌症 DNA 的分布直方图变化情况对化疗效果进行评估，这对于癌症的化疗具有重要的指导意义。

　　3.3  在免疫学中的应用

　　随着单克隆抗体技术、荧光色素技术的发展，流式细胞仪以其快速、定量测量的特点，被广泛应用于免疫理论研究和临床实践当中。通过与荧光抗原抗体结合，对细胞表面和细胞内部的抗原、癌细胞基因蛋白定量分析，实现细胞分类和亚群分析，这对于各种血液病、癌症、B细胞淋巴瘤的早期诊断和治疗以及对人体细胞免疫功能的评估都具有十分重要的现实意义。通过对患者淋巴细胞各个亚群数量的检测可以了解淋巴细胞的分化功能，同时，通过对疾病的特异性淋巴细胞亚群或者细胞表面标记物的存在、缺失和过度表达等的研究，可以对一些免疫性疾病、 感染性疾病和肿瘤等进行早期诊断和治疗。 此外，还可以利用流式细胞仪进行组织相容性抗原群体分析和器官移植和移植后免疫状态监测。

　　3.4 在血液学中的应用

　　临床中通过对外周血 T 淋巴细胞 、骨髓细胞表面抗原和细胞内DNA 含量的检测，可以对包括白血病、淋巴瘤等多种血液病进行早期诊断、及时治疗和愈后情况的判断。由于各类血细胞都具有特异的抗原，流式细胞仪通过采用特异的抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体，结合荧光染料，就可以测定某个细胞的多项参数，准确地判断细胞属性。流式细胞仪能够在患者恢复期检测体内是否还有残留的病变细胞，这对于及早发现并采取有效措施防止白血病等疾病的复发具有极其重要的现实意义。上述应用只是流式细胞仪广泛应用的一个缩影，流式细胞仪在细胞凋亡检测、器官移植、精子性别控制、临床细菌学、植物学等诸多领域都有十分广泛的应用。可以预见，随着激光、探测器、计算机技术等相关技术的发展，流式细胞仪也将会有更加广泛的应用前景。