高效液相色谱仪的使用方法及应用

　　高效液相色谱仪的使用方法

　　1、开机设定参数（检测波长、流速），更换所需流动相，检查色谱柱是否正确。

　　2、排液置换管路中流动相，冲洗进样阀，洗好进样针。

　　3、冲洗色谱柱进行平衡，其间可提前进行样品的处理，样品信息的注册。

　　4、平衡好以后进空白试验，排除系统污染。

　　5、柱子稳定好以后进样，等待运行结束（其间清洗进样针），积分计算，出具报告。

　　详细操作步骤如下：

　　1、 开机操作：

　　（1）、打开电源，用Harb相连接时，注意Harb电源，打开计算机，打开Bootp Server（一般启动时已打开）；

　　（2）、自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时（有六行字符），打开工作站（先打开On line）；

　　（3）、打开冲洗泵头的10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准；

　　（4）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液；

　　（5）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。

　　2、 先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相），正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命；

　　3、 建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；

　　4、 使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；

　　5、 溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；

　　6、 实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分钟以上，再用甲醇冲洗。冲洗过程中关闭D灯、W灯；

　　7、 关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶液的开关；

　　8、 使用者须认真履行仪器使用登记制度，不要擅自拆卸仪器。

　　流动相：

　　1、 流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；

　　2、 水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；

　　3、 使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相；

　　A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。

　　样品：

　　1、 采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；

　　2、 用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；

　　手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；

　　色谱柱：

　　1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；

　　2、 使用符合要求的流动相；

　　3、 使用保护柱；

　　4、 如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。

　　5、 色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；

　　6、 不要高压冲洗柱子；

　　7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；

　　高效液相色谱仪的特点

　　高压——压力可达150～300 kg/cm2。色谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。

　　高速——流速为0.1～10.0 mL/min。

　　高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。

　　高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。

　　HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：

　　速度快——通常分析一个样品在15～30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。

　　分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

　　灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。

　　色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。

　　样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

　　高效液相色谱仪的应用

　　高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。

　　与试样预处理技术相配合，HPLC 所达到的高分辨率和高灵敏度，使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能，能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展，有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。

　　HPLC成为解决生化分析问题最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用，流出组分易收集等优点，因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。

　　液相色谱- 质谱联用技术受到普遍重视，如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等； 液相色谱- 红外光谱联用也发展很快，如在环境污染分析测定水中的烃类，海水中的不挥发烃类，使环境污染分析得到新的发展。