智能化的便携式流感诊断系统设计方案

　　聚合酶链反应（PCR）热循环是进行分子诊断的黄金准则。然而，在应对流感大流行方面，全球所面临的主要挑战是只有专业人员才能进行有效的诊断测试。此外，商业上可用的热循环仪也只能用于实验室环境使用，因此，我们很难对其进行操作，要将商用热循环仪的应用领域扩大到紧急情况下，以及公共检测站，例如机场，其笨重且昂贵的特性无疑是一个障碍。因此，迫切需要我们开发一种便宜的，可携带的，且可任意使用的分子诊断工具。

　　为了提供灵活的，成本低廉的诊断系统，我们在新加坡生物工程和纳米技术研究所的研究小组开发了一个小型诊断系统，该诊断系统采用美国疾病控制和预防中心（CDC）所推荐的PCR 技术来检测传染性急病。我们的系统从实时PCR到病毒基因目标链的检测对整个诊断过程进行整合与自动化，以执行数据的分析。

　　通过使用NI 公司的CompactDAQ硬件系统，以及用于控制和数据分析的LabVIEW图形化系统设计软件作为我们的解决方案，我们创建了一个小型且便携式的系统。该系统由一个较小的珀尔帖器（温度装置），电源供应器（能量装置），和具有USB接口即插即用功能的光检测器（光学装置）构成。

　　我们的热循环仪是便携式的，完全自动化的，且可用于在重要场合中大规模健康检查的情况下使用，例如在机场检查站控制传染性疾病的传播。系统自动化是可靠诊断的一个关键优势，因为流感大流行可能会在偏远地区发生，那里可能没有受过专业训练的人员处理试验样品。此外，系统自动化的实现大大降低了人力和培训费用。

　　利用该系统同时运行包含预加载PCR反应物的三个聚合物，从抽样到结果所花费时间不到一小时，并且允许采用大量生物的多样性。利用热敏电阻的实时温度反馈，一个内部比例积分微分（PID）芯片来处理温度控制。该控制器由一个补偿器，输出装置和传感器反馈信号组成，反馈信号对于控制加热器输出功率，以及保持温度是很必要的。使用LabVIEW软件，我们对图形用户接口进行编程，以显示实时温度，设置温度，并且显示来自三个通道的实时PCR结果 （如图1A所示）。

　　系统配置

　　整个集成系统的配置包括执行PCR系统运行和反应的循环温控系统、固定安装的三个蓝色LED光源、排布于LED至光电倍增管（PMT）光路之间用于实时光学探测的相关透镜和滤波器。系统中包括一组铜制或黄铜制的加热室，与放置样本的聚合体反应室集成在一起。

　　LabVIEW是系统构架的核心，中心处理器单元的设计专门针对执行由LabVIEW预编写的指令，可用于控制系统启动和健康检查、PCR运行的热量循环控制、和多路复用荧光信号的光学检测。

　　在PCR处理的循环温控过程中，系统于退火循环的最后一秒进行光学检测。三个LED同时由来自NI 9265模拟输出模块的电流驱动依次点亮，每个LED持续发光200 ms，在下一个LED灯点亮前熄灭当前LED灯。

　　特殊设计的装置用于聚焦和引导LED光路传输。光在照射到放置DNA样本的反应室之前要先通过一个滤波器。光线在到达PMT之前还需通过一系列透镜和滤波器，最后由NI 9206模拟输入模块读出该信号。

　　我们使用LabVIEW来进行信号处理以获取数据集的均值，来自PMT的信号被放大并处理。之后将向用户显示数据，并通过主用户菜单将该数据连续更新于三个独立的曲线图中（见图2）。

　　PCR 混合物被置于聚碳酸酯PCR反应室中，并加油以防止蒸发。PCR在以下温度条件下完成：95 °C下持续20秒（Taq聚合酶活化） 、50 次循环的放大（在95 °C下保持5秒进行加热变性、在60 °C保持60秒进行退火和延伸）。LabVIEW程序记录每次循环中DNA复制发出的荧光。

　　稳定性和重用性

　　在分子诊断中，PCR是一种将特定DNA片段放大至分子级别的常用方法。在实现过程中，需要在94 °C下进行40至50次循环的热变，在60 °C下进行退火，在60 °C下进行延伸。整个过程的关键点在于精确的温度控制，保持2 °C/s的温度上升率，以避免产生或放大错误的DNA序列。

　　我们使用LabVIEW来控制独立的高端和低端参考输出通道，并采用一块由高速金属氧化物半导体场效应晶体管（MOSFET）组成的电路，设计并制造了片上加热方案，实现了PWM实时控制。温度测量显示，我们获得的加温和冷却率分别为2.5 °C/s和2.2 °C/s。对于每一路的温度设置，过冲小于1 °C，并且稳定性保持在±0.1 °C。

　　结果与结论

　　我们使用1至104的TaqMan探针，通过连续稀释的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）互补DNA（cDNA） 来确认PCR的实时探测性能。结果证实，从Ct曲线中确定的敏感度与市场上的实时热循环仪（图1B）性能相当。

　　与市面上其它的热循环仪相比，我们的系统更紧凑、便携性更高，且恒温性更好（表1）。系统的便携性使其在大范围流感爆发的早期发挥更大的作用。同时，该诊断系统非常适合在门诊、急诊室、公共检查站点等地使用。此外，由于其便携性好、价格低、体积小、且使用方便等特点，该热循环仪在食品安全方面具有潜在的优势。