现场检测用谷丙转氨酶光学生物传感器研究

　　何保山，周爱玉，李华清，岳伟伟，罗金平，蔡新霞

　　(1.中国科学院 电子学研究所传感技术国家重点实验室，北京 100080；2.中国科学院 研究生院，北京 100080)

　　1 引言

　　ALT也称作丙胺酸氨基转移酶，广泛存在于机体内各器官组织中。在肝、心、肾、胰、脑、肺、肌肉、骨骼等器官组织细胞中，都含有不同程度的ALT，但以肝脏含量为最多，存在于肝细胞浆中。ALT主要代谢功能是可以催化丙胺酸和α-酮戊二酸可逆转换成丙酮酸和谷氨酸。当肝细胞受损时，大量的ALT就会释放进入血液循环系统中，升高的ALT酶活被认为是肝细胞损伤的最特异性标志物之一。

　　我国卫生部规定，血清ALT检验足献血员健康体检必查项目之一，同时规定献血者的血液ALT检测方法采用赖氏法或全自动生化仪的速率法。但这两种方法存在的主要问题是赖氏法耗时长，准确性差，受主观因素影响大。而速率法虽然准确，但仪器庞大，价格昂贵，需专业人士操作。面对现在街头无偿献血者因血清ALT高造成大量不必要的献血和血液浪费问题，非常有必要建立一种快速灵敏、准确方便的ALT检测方法，这将对开展血清中ALT研究和“窗口期”肝炎预防具有非常重要的现实意义。

　　基于光的吸收／反射原理和酶促反应原理，本文介绍了一种新型的谷丙转氨酶光学生物传感器，将反应底物和指示剂依次固定在敏感膜中制作成生物传感器，这种传感器可以用于血清ALT的快速检测，制作简单，成本低，适于一次性使用，在血液筛查方面具有良好的应用前景。

　　2 实验部分

　　2.1 试剂

　　丙胺酸、α-酮戊二酸、谷丙转胺酶(ALT，EC2.6.1.2，from porcine heart，84 U／mg)、丙酮酸氧化酶(PyOD，EC1.2.3.3，8.9 U／mg)、磷酸缓冲盐片(PBS，0.01 mol／L，pH 7.4)购自美国Sigma公司；辣根过氧化物酶(POD，EC1.11.1.7，fromGrade I，horseradish，250 U／mg)购自德国Roche公司；3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)、硫酸镁、磷酸钠购自北京欣经科生物技术有限公司。以上试剂均为分析纯，溶液皆用去离子水配制，最终调节溶液pH值为7.4。实验在室温下进行。

　　血清样本由北京医院临床检验中心和北京市红十字血液中心提供。

　　2.2 检测原理

　　利用光的吸收／反射原理埘血清中ALT进行快速检测。首先血清中ALT催化丙胺酸和α-酮戊二酸转化生成丙酮酸和谷氨酸，丙酮酸在磷酸根和丙酬酸氧化酶的作用下氧化生成乙酰磷酸和过氧化氢，生成的过氧化氢具有强氧化性，可以将还原性的指示剂3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)氧化生成蓝色化合物，致使敏感膜发生颜色变化。敏感膜颜色的深浅与过氧化氢的量直接相关，而过氧化氢又只与样本中ALT的含量相关，因此通过光分析系统灵敏感知敏感膜颜色的变化即可得知样本中ALT的含量，反应原理为

　　2.3 ALT光学生物传感器的制备

　　本新型光学生物传感器由敏感膜、保护膜和基底三部分组成，分别由划片机切割成所需尺寸，用粘合剂粘结成形(如图1所示)。其中敏感膜用配好的反应试剂和指示剂先后滴加其上，置于室温风干，最后封盖透明保护膜即可备用。

　　2.4 传感器系统组成及测量方法

　　图2为传感器系统组成的框图。以带有数据传输接口的微处理器为中枢，通过数模接口向SP62光源发送调制信号。控制光源在预定的条件下启动，通过模数接口自动读取特定波长下的光信号，并即时显示数据结果。

　　测试时取血清试样10 μL滴加在敏感膜的中央，启动仪器检测，同时计时开始，待试样扩散均匀后，封盖透明保护膜，将传感器插入测试仪器，约60 s，自动读取光信号值，依据预先置入的反射值与ALT浓度的响应关系，即可定量检测血清中ALT的含量。

　　3 结果与讨论

　　图3所示的是不同浓度ALT在可见光区域内的全波长扫描图。其中a，b，c，d，e对应的ALT浓度分别为1000，500，250，100，25 U／L。由图中可以看出，当传感器加入ALT后，波长为400～700nm，生成的蓝色产物在波长660 nm处出现了特异性的吸收，并且随着ALT浓度N的增加，传感器敏感膜蓝色加深，光吸收增强，波长660 nm处反射值逐渐降低，这说明本光学生物传感器在660 nm处分辨率最好，灵敏度也最高，这与监色物质对白光的吸收／反射特性是一致的。

　　实验表明样本中ALT浓度N和波长660 nm处反射值是线性相关的。图4是利用ALT光学生物传感器检测人体血清的响应关系图。血清样本由北京市红十字血液中心提供，在20～150 U／L均匀选择6个样本，每个样本测试3次，检测时间60 s。实验发现，在20～150 U／L内，血清ALT浓度N和反射值表现出较好的线性关系y=0.0372x+66.055，R=0.987，线性相关系数为0.987，可以实现对血清ALT的现场快速检测。

　　4 结 论

　　尽管对患有肝病病人的诊断中ALT具有非常重要的临床意义，但很少有可用于肝病现场快速诊断的传感器出现。2003年，G．S．Xuan等人报道了一种固定有ALT抗体的电化学免疫传感器，虽然此传感器系统对ALT表现出优良的检测速度和精度，但它的形式结构却比较复杂，检测上限受到抗体特性的限制。本文基于光的吸收／反射原理和酶促反应原理提供了一种新型的ALT光学生物传感器，反应底物和指示剂依次固定在敏感膜中制作成生物传感器，其血清ALT检测时间60 s，检测范围20～150 U／L，线性相关系数为0.987。并且这种生物传感器制作简单，耗样少(10 μL)，一次性使用，避免交叉感染，具有良好的临床医学应用前景。